Əksər virusların genomik ardıcıllığı məlumdur.DNT-nin qısa seqmentləri olan nuklein turşusu zondları tamamlayıcı viral DNT və ya RNT seqmentləri ilə hibridləşmək üçün nəzərdə tutulmuşdur.Polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) virusu aşkar etmək üçün daha effektiv üsuldur.Bu yaxınlarda yüksək məhsuldar diaqnostik üsullar hazırlanmışdır.
A. Nuklein turşusunun hibridləşdirilməsi texnikası
Əsasən Southern blotting (Cənub) və Northern blotting (Şimal) daxil olmaqla, nuklein turşusunun hibridləşdirilməsi virus diaqnostikası sahəsində sürətlə inkişaf edən yeni bir texnikadır.Hibridləşmə analizinin əsası tamamlayıcı viral DNT və ya RNT seqmentləri ilə hibridləşdirmə üçün nəzərdə tutulmuş qısa DNT seqmentlərindən (“zond” adlanır) istifadə etməkdir.İstilik və ya qələvi müalicə ilə, cüt zəncirli hədəf DNT və ya RNT tək zəncirlərə ayrılır və sonra möhkəm dayaq üzərində hərəkətsizləşdirilir.Bundan sonra, zond əlavə edilir və hədəf DNT və ya RNT ilə hibridləşdirilir.Zond izotop və ya qeyri-radioaktiv nuklid ilə etiketləndiyi üçün hədəf DNT və ya RNT avtoradioqrafiya və ya biotin-avidin sistemi vasitəsilə aşkar edilə bilər.Viral genomların çoxu klonlaşdırılıb və ardıcıllaşdırılıb, onlar nümunədə zond kimi virusa xas ardıcıllıqlardan istifadə etməklə aşkarlana bilər.Hal-hazırda hibridləşdirmə üsullarına aşağıdakılar daxildir: nöqtə ləkəsi , hüceyrələrdə in situ hibridləşdirmə , DNT ləkələmə (DNT) (Cənub ləkəsi) və RNT ləkəsi (RNT) (Şimal ləkəsi).
B.PCR Texnologiyası
Son illərdə həssas olmayan və ya yetişdirilə bilməyən virusları sınamaq üçün PCR əsasında bir sıra in vitro nuklein turşusunun gücləndirilməsi üsulları hazırlanmışdır.PCR, in vitro polimeraza reaksiyası ilə spesifik DNT ardıcıllığını sintez edə bilən bir üsuldur.PCR prosesi üç mərhələdən ibarət termal dövrə daxildir: denaturasiya, yumşalma və uzadılma Yüksək temperaturda (93℃~95℃) ikiqat zəncirli DNT iki tək DNT zəncirinə ayrılır;sonra aşağı temperaturda (37℃~60℃), iki sintez edilmiş nukleotid primeri tamamlayıcı DNT seqmentlərinə bağlanır;Taq fermenti üçün uyğun temperaturda (72℃), yeni DNT zəncirlərinin sintezi şablon kimi tamamlayıcı DNT və material kimi tək nukleotidlərdən istifadə edərək primer 3-dən başlayır.Beləliklə, hər dövrdən sonra bir DNT zənciri iki zəncirə gücləndirilə bilər.Bu prosesi təkrarlayaraq, bir sikldə sintez edilən hər bir DNT zənciri növbəti dövrədə şablon kimi istifadə oluna bilər və hər dövrədə DNT zəncirlərinin sayı ikiqat artır, bu da PCR istehsalının 2n log sürətində gücləndirilməsi deməkdir.25-30 dövrədən sonra elektroforez vasitəsilə PCR istehsalı müəyyən edilir və xüsusi DNT məhsulları UV işığında (254nm) müşahidə edilə bilər.Spesifiklik, həssaslıq və rahatlıq üstünlüyü üçün PCR HCV, HİV, CMV və HPV kimi bir çox viral infeksiyaların klinik diaqnostikasında qəbul edilmişdir.PCR çox həssas olduğundan, virus DNT-ni fg səviyyəsində aşkarlaya bilir, yanlış pozitivliyin qarşısını almaq üçün əməliyyat çox diqqətlə aparılmalıdır.Bundan əlavə, nuklein turşusu testinin müsbət nəticəsi nümunədə canlı yoluxucu virusun olması demək deyil.
PCR texnikasının geniş tətbiqi ilə müxtəlif test məqsədləri üçün PCR texnikasına əsaslanan yeni texnika və üsullar hazırlanır.Məsələn, real vaxtda kəmiyyət PCR virus yükünü aşkar edə bilər;in situ PCR toxuma və ya hüceyrələrdə virus infeksiyasını müəyyən etmək üçün istifadə olunur;Yuvalanmış PCR PCR-in spesifikliyini artıra bilər.Onların arasında real vaxtda kəmiyyət PCR daha sürətlə işlənib hazırlanmışdır.TaqMan hidroliz zondu, hibridləşmə zondu və molekulyar mayak zondu kimi bir çox yeni üsullar klinik tədqiqatlarda geniş istifadə olunan real vaxt kəmiyyət PCR texnikasında birləşdirilib.Xəstələrin bədən mayesindəki virus yükünü dəqiq müəyyən etməklə yanaşı, bu üsul həm də dərmana dözümlü mutantı aşkar etmək üçün istifadə edilə bilər.Buna görə də, real vaxtda kəmiyyət PCR əsasən müalicəvi təsirin qiymətləndirilməsi və dərman tolerantlığının monitorinqində tətbiq edilir.
C. Viral nuklein turşularının yüksək məhsuldarlıq aşkarlanması
Yeni ortaya çıxan yoluxucu xəstəliklərin sürətli diaqnostika ehtiyaclarını ödəmək üçün DNT çipləri (DNT) kimi müxtəlif yüksək məhsuldarlıqlı aşkarlama üsulları yaradılmışdır.DNT çipləri üçün xüsusi zondlar sintez edilir və nümunə ilə hibridləşdirilə bilən DNT zond mikroarrayını (DNT) yaratmaq üçün çox yüksək sıxlıqda kiçik silisium çiplərinə yapışdırılır.Hibridləşmə siqnalı konfokal mikroskop və ya lazer skaneri vasitəsilə təsvir oluna və kompüterdə daha sonra emal oluna və müxtəlif genlərə aid nəhəng məlumat toplusu əldə edilə bilər.İki növ DNT çipi var."Sintez çipi" aşağıdakı kimidir: xüsusi oliqonukleotidlər birbaşa çiplərdə sintez olunur.Digəri DNT hovuz çipidir.Klonlanmış genlər və ya PCR məhsulları slaydda ardıcıl olaraq çap olunur.DNT çip texnologiyasının üstünlüyü çoxlu miqdarda DNT ardıcıllığının eyni vaxtda aşkarlanmasıdır.Patogen aşkarlama çipinin ən son versiyası eyni anda 1700-dən çox insan virusunu müəyyən edə bilir.DNT çip texnologiyası ənənəvi nuklein turşularının hibridləşdirilməsi üsullarının problemlərini həll etdi və viral diaqnostika və epidemioloji tədqiqatda çox geniş tətbiqlərə malikdir.
Göndərmə vaxtı: 23 dekabr 2020-ci il